1. munkaszakasz:

 

A projekt első munkaszakaszában elindult az első patkányvonal felállítása: megtörtént az SB-CAG-GCaMP2 transzpozonos konstrukció mikroinjektálása embriókba, és az ebből megszületett első transzgenikus patkányegyedek genetikai és szöveti expressziós vizsgálata. A speciális CAG promótertől azt várjuk, hogy szövetspecifikusan erős expressziót ad szívizomsejtekben, de más szövetekben is releváns szinten kifejezi az alkalmazott kalcium szenzorfehérjét.

Az említett munkával párhuzamosan elvégeztük többféle, érzékenyebb kalcium szenzorfehérje (pl. GCaMP3, RGECO1) karakterizálását, illetve elkészültek olyan, mikroinjektálásra alkalmas transzpozon alapú vektorok, amelyek képesek a kalcium érzékelők konstitutív, ill. szövetspecifikus expressziójának a kiváltására. Beszerzésre és beállításra került továbbá egy két-foton optikai rendszer, amely időben és térben nagyfelbontású kalciumjel detektálást tesz majd lehetővé.

 

2. munkaszakasz:

 

A előző munkaszakaszban elindított transzgenikus patkányok több generáción keresztül történő, kombinált genotípus/fenotípus alapú szelekciójával sikerült előállítanunk egy stabil homozigóta patkányvonalat. A vonal genetikai karakterizálásához beállításra került egy patkány genomra specifikus, real-time PCR alapú kópiaszám meghatározási módszer, amellyel igazoltuk, hogy az egyedek haploid egykópiás formában tartalmazzák az SB-CAG-GCaMP2 expressziós kazettát. Meghatároztuk a transzgén pontos genomi integrációs helyét, és kiderült, hogy az integrációnak detektálhatóan nincs káros élettani hatása.

Az egyedek szöveti expressziós vizsgálatai során kiderült, hogy a CAG-GCaMP2 nagyon jól expresszálódik szív-, máj- és veseszövetekben, és in vitro és in vivo kalcium mérésekkel igazoltuk, hogy ez a patkányvonal nagyon jó farmakológiai vizsgálati modellje lehet az ezen szövetek kalciumháztartását befolyásoló gyógyszerjelölt molekuláknak. Idegrendszeri eredetű sejtekben azonban nagyon alacsony expressziót tapasztaltunk, így más konstitutív (pl. PGK), illetve neuron (rNSE) és glia (rGFAP) specifikus promóterekkel meghajtott expressziós kazettákat állítottunk elő. Transzpozon alapú vektorok segítségével teszteltük a konstrukciókat primer tenyészeteken, ahol a bejuttatott GCaMP3 és RGECO1 kalcium szenzorfehérjék megfelelő expressziós szinteket mutattak. A vizsgálatok alapján elindítottuk a mikroinjektálásokat 2 újabb patkányvonal, az SB-PGK-GCaMP3 (konstitutív expresszió) és az SB-rGFAP-RGECO1 (glia specifikus expresszió) előállításához.

 

3. munkaszakasz:

 

Befejeződött a korábban létrehozott SB-CAG-GCaMP2 homozigóta patkányvonal karakterizálása: kariotípus vizsgálattal igazoltuk, hogy az egyedek kromoszómális szinten is több generáción keresztül stabilak. Célzott szöveti vizsgálatokkal (szív, vese, máj) további bizonyítékokkal szolgáltunk, hogy ez a patkányvonal alkalmas ezen szövetek kalciumháztartását befolyásoló gyógyszerjelöltek farmakológiai tesztelésére. A munkákból egy szabadalmi beadvány mellett több tudományos közlemény is készül.

Az előző munkaszakaszban megindított 2 újabb injektálás mellett elvégeztük egy harmadik, neuron specifikus expressziót biztosító transzpozonos konstrukció (SB-rNSE-GCaMP3) mikroinjektálását. Az új injektálásokból született egyedek két generációs genetikai vizsgálatát követően elkezdtük a szöveti expresszió karakterizálását, hogy kiválogathassuk a stabil homozigóta vonal felállítására alkalmas egyedeket. A konstitutív (SB-PGK-GCaMP3) expressziós kazettát tartalmazó egyedek genetikailag stabilnak bizonyultak, és bár alacsony szöveti expressziós szintet mutatnak, további tenyésztésre alkalmasnak bizonyultak. A glia specifikus (SB-rGFAP-RGECO1) konstrukció mutatott némi toxicitást, de sikerült genetikailag stabil egyedeket találnunk, amelyek további tenyésztését követően megindulhatnak a szöveti expressziós vizsgálatok. A neuron specifikus konstrukció (SB-rNSE-GCaMP3) több próbálkozás (injektálások, szelekció) ellenére is genotoxikusnak bizonyult, így abból stabil vonalat nem lehet előállítani.

 

4. munkaszakasz:

 

Az utolsó munkaszakaszban megtörtént a projekt során előállított patkányvonalak genetikai jellemzése, és elindult a fenotípusos karakterizálásuk. Az új injektálásokból származó vonalak közül a konstitutív promóterrel rendelkező SB-PGK-GCaMP3 konstrukciótól azt vártuk, hogy minden szövetben megfelelő módon kifejezi a kalcium szenzorfehérjét. Több, független genomi integrációval rendelkező homozigóta egyedet is megvizsgáltunk, de annak ellenére, hogy genetikailag mindegyik stabilnak bizonyult, egyik esetben sem tudtuk a vizsgált szövetekben megfelelő mértékű expressziót kimutatni. Ennek minden valószínűség szerint az lehet az oka, hogy a PGK promóter a humán sejtekkel ellentétben a patkány genomiális környezetben nem működik megfelelően, így ezt a vonalat a továbbiakban nem lehetett használni.

Nagyon ígéretesnek bizonyult ugyanakkor a gliaspecifikus promóterrel meghajtott SB-rGFAP-RGECO1 kazettát tartalmazó patkányvonal egyedeinek a vizsgálata. A vártnak megfelelően az idegrendszer gliasejtjeiben magas szinten expresszálódott a piros fluoreszcens kalcium szenzorfehérje, és az előzetes kísérletek során a fluoreszcencia változás detektálásával jól lehetett követni a mesterséges módon kiváltott kalcium szignálokat. Az eredmények alapján úgy tűnik, hogy ez a patkányvonal a jövőben alkalmas lehet a gliasejtekben lezajló kalcium hullámok monitorozására, és ezen keresztül a gliasejtek élettani és farmakológiai vizsgálatára. A pozitív eredmények hatására felmerült az az ötlet, hogy keresztezzük egymással az SB-CAG-GCaMP2 (zöld szenzorú) patkánytörzs és az SB-rGFAP-RGECO1 (piros szenzorú) patkánytörzs homozigóta egyedeit, ugyanis az utódok segítségével kialakítható egy olyan vonal, amely mindkét transzgént homozigóta formájában tartalmazza. Sikerült is ezt véghezvinni, és az előzetes genetikai vizsgálatok megerősítették, hogy valóban a megfelelő genotípusú egyedek jöttek létre. Ennek az újabb vonalnak tudományos szempontból az lenne a hatalmas előnye, hogy az egyedek alkalmasak lennének neuronok és gliasejtek szimultán vizsgálatára.

A kutatási tervben vállaltaknak megfelelően folytattuk a létrehozott patkányvonalak egyedeiből származó sejttenyészeteken végzett farmakológiai vizsgálatokat. A konstitutív promóterű SB-CAG-GCaMP2 vonal különösen alkalmas erre, hiszen erős transzgén expressziót mutat szív-, vese- és májsejtekben. Kimutattuk például, hogy bizonyos antihisztamin ágenseknek (terodiline, terfenadine), illetve egy antimaláriás szernek (mefloquine) a kalcium háztartás zavarán keresztül is mérhető kardiotoxikus mellékhatásai vannak. Más kísérletek során több sejttípusban is igazolni tudtuk, hogy az iszkémia-reperfúziós patológiás állapotot abnormális kalcium szignálok követik, amelyek megjelenése eliminálható egy nátrium-kalcium cseretranszporter fehérje gátlásával. Az eredményeket több hazai és nemzetközi konferencián, előadások és poszterek formájában is bemutattuk, illetve több rangos nemzetközi folyóiratban publikáltuk. A konzorciumi partnerek együttműködése kapcsán a kidolgozott módszerekre és az előállított patkányvonalakra szabadalmi kérvényt nyújtottunk be, amellyel sikerült előkészítenünk a projektben megfogalmazott, üzleti hasznosításra irányuló vállalásunkat. A projekt rendkívül sikeresnek mondható, hiszen sikerült előállítanunk több olyan, tudományos szempontból nagyon értékes patkányvonalat, amelyek farmakológiai és toxikológiai hasznosításuk okán mindenképpen piacra vihetők, és ezáltal alkalmasak a beleinvesztált szellemi és anyagi értékek üzleti célú hasznosítására.

 

Előrehaladás

TRANSRAT
Project

© TRANSRAT

A TRANSRAT projekt száma: KMR_12-1-2012-0112

További információ: Dr. Orbán Tamás | orbant biomembrane p hu